Внутренний контроль пцр

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

В настоящее время система состоит из 141 раздела (89 собственных разделов ФСВОК и 52 раздела, совместных с зарубежными системами внешней оценки качества), охватывающих все основные виды клинико-лабораторных исследований. Ежегодно в ФСВОК участвует около семи тысяч клинико-диагностических лабораторий Российской Федерации.

Основными разделами ФСВОК относительно ПЦР являются:

· ПЦР – выявление микобактерий туберкулеза

· Молекулярно-генетическое выявление лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза

· ПЦР – выявление вируса гепатита В (HBV)

· ПЦР – выявление HCV

· ПЦР – выявление ВИЧ

· ПЦР – выявление C. trachomatis, M. hominis, U. urealiticum

· ПЦР – выявление N. gonorrhoeae

· ПЦР – выявление вируса папилломы человека (ВПЧ)

· Количественное определение ДНК вируса гепатита В (ВГВ) методом ПЦР

· Количественное определение РНК вируса гепатита с (HCV) методом ПЦР

Внутренний контроль качества

Порядок проведения внутрилабораторного контроля качества определяется в МУ1.3.2569-09 следующими мероприятиями:

В лаборатории, использующей методы амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) в диагностических целях, проводят внутрилабораторный контроль качества проводимых исследований с периодичностью, зависящей от объема выполняемой работы и определяемой руководителем лаборатории, но не реже одного раза в квартал.

При проведении внутрилабораторного контроля качества лабораторных исследований могут использоваться аттестованные на наличие аналита (его количества) панели производителей коммерческих наборов или внутрилабораторные аттестованные образцы, содержащие и не содержащие нуклеиновые кислоты конкретных возбудителей в различной концентрации, стабильные в условиях хранения.

Реализация указанных положений возможна при использовании следующих подходов:

1. Постановка внутренних контролей (ВК)

2. Использование отрицательных контрольных образцов (К-)

3. Использование положительных контрольных образцов (К+)

4. Постановка специальных контролей

5. Регулярные смывы с поверхностей

Препарат ДНК, подготовленный к ПЦР из биологического материала, может содержать примеси ингибиторов, заметно снижающих эффективность реакции, а в некоторых случаях и приводящих к отсутствию специфических ампликонов даже при наличии искомого возбудителя. Поэтому становится необходимым контролировать ход амплификации в каждой пробирке с реакционной смесью. Для этой цели в каждую пробирку добавляют дополнительный, так называемый, внутренний контроль. Он представляет собой любой препарат ДНК, несхожий с ДНК искомого микроорганизма. Для инфекционных тест-систем иногда используют, например, β-глобиновый ген, к концам которого с помощью генно-инженерных манипуляций «пришивают» участки ДНК, гомологичные праймерам, входящим в состав тест-системы.

При отсутствии регистрации внутреннего контроля и выявления специфической ДНК результат следует считать недостоверным. В этом случае для данного исследуемого образца рекомендуется перевыделить ДНК.

Если внутренний контроль внести в реакционную смесь, то он станет такой же мишенью для отжига праймеров, как и ДНК искомого возбудителя инфекции. Размер продукта амплификации внутреннего контроля подбирают таким образом, чтобы он отличался от специфических ампликонов в 2 и более раз. В результате, если внести ДНК внутреннего контроля в реакционную смесь вместе с испытуемым образцом, то независимо от наличия микроорганизма в биологическом образце, внутренний контроль станет причиной образования ампликонов, которые отличаются по размеру от специфических ампликонов, получаемых после постановки ПЦР в присутствии специфической ДНК микроорганизма.

Наличие ампликонов внутреннего контроля в реакционной смеси будет свидетельством нормального прохождения реакции амплификации и отсутствия ингибиторов. Если ампликоны нужного размера не образовались, но не образовались также и ампликоны внутреннего контроля, можно сделать вывод о возникшей проблеме при прохождении ПЦР как следствие наличия в анализируемом образце нежелательных примесей, от которых следует избавиться, либо технологических нарушений. В любом случае результат реакции следует признать недостоверным.

Важно отметить, что если в реакционной смеси находится нужная ДНК, то эффективность ее амплификации может заметно снижаться из-за конкуренции за праймеры с ДНК ВК. Это особенно заметно при низких концентрациях ДНК в испытуемом образце и может приводить к ложноотрицательным результатам. Поэтому концентрация внутреннего контроля должна быть такой, чтобы не составлять конкуренции для амплификации даже единичных искомых молекул ДНК.

Количественный анализ ВК позволяет в каждой пробе оценивать потери выявляемой ДНК/РНК на стадии пробоподготовки, а также определить снижение эффективности за счет ингибиторов обратной транскрипции или ПЦР. В связи с этим ВК должен удовлетворять следующим требованиям:

· Амплификация ДНК ВК должна происходить и регистрироваться независимо от присутствия и количества искомой ДНК в реакционной смеси для всего диапазона определяемых концентраций, т. е. ВК не должен быть конкурентным.

· Эффективность амплификации ВК и исследуемых проб должна быть одинаковой, а ее количество должно соответствовать линейному участку диапазона определяемых концентраций ДНК-мишени.

· В случае диагностики инфекций, вызываемых РНК-содержащими вирусами, в состав ВК должен входить целевой фрагмент специфической РНК, из которой перед проведением ПЦР будет синтезирована кДНК посредством обратной транскрипции. Применение ВК на основе ДНК-конструкций при количественном анализе РНК не позволяет учитывать ее потери за счет повышенной физической и ферментативной деградации, а также контролировать процесс обратной транскрипции.

Положительный контроль позволяет удостовериться, что все компоненты, входящие в состав реакционной смеси, обеспечивают нормальное прохождение реакции. Для этого используют препарат ДНК, содержащий сайты для отжига праймеров, например, ДНК искомого микроорганизма или клонированные специфические участки его генома. Неспецифические ампликоны отличаются по размеру от ампликонов, образующихся в результате амплификации с контрольным препаратом ДНК. Они могут быть как большего, так и меньшего размеров по сравнению с положительным контролем. В худшем случае их размеры могут совпадать и читаются в электрофорезе как положительные.

Для контроля специфичности образуемого продукта амплификации можно использовать гибридизационные зонды, меченные флуоресцентными метками или радиоактивными изотопами и взаимодействующие с ДНК в соответствии с теми же принципами, что и праймеры.

Отрицательный контроль включает в себя все компоненты реакции, но вместо клинического материала или препарата ДНК вносится соответствующее количество деионизованной воды или экстракта, не содержащего исследуемой ДНК. Отрицательный контроль необходим для проверки компонентов реакции на отсутствие в них ДНК или клеток возбудителя вследствие контаминации и исключения учета ложноположительных результатов.

Использование специальных контролей при постановке ПЦР позволяет решить ряд задач, в первую очередь, касающихся оценки эффективности процесса амплификации и контроля специфичности полученных результатов, а также дает возможность реализовать подход к количественному анализу ДНК.

Принципиальным моментом является постановка специальных контролей при исследовании сложных многокомпонентных систем, таких как биоценозы, поскольку появляется возможность качественного и количественного анализа взаимодействия компонентов системы и характеристики их отношения к биотопу.

К специальным контролям можно отнести следующее:

· Маркеры длин фрагментов ДНК

· Стандарты и калибраторы

Контроль взятия материала (КВМ)

Маркеры длин фрагментов ДНК используются при детекции результатов ПЦР методом гель-электрофореза. Стандарты (маркеры) представляют собой фрагменты двуцепочечной ДНК строго определенной длины, позволяющие идентифицировать и охарактеризовать полосы, полученные в геле, и оценить результаты анализа с точки зрения их специфичности.

Наиболее актуален при использовании метода гибридизации в процессе амплификации. Это обусловлено тем, что помимо флуоресценции, возрастающей пропорционально синтезу ампликонов (ПЦР-РВ) или определяющейся после амплификации (FLASH), прибор регистрирует фоновую флуоресценцию, величина которой зависит от: свойств меченых зондов; изменения концентрации отдельных компонентов реакционной смеси в зависимости от серии, режима и продолжительности хранения; используемого пластика; особенностей регистрирующей аппаратуры.

Анализ величины целевого сигнала от ампликонов над фоновой флуоресценцией и шумами в процессе ПЦР-РВ позволяет установить некоторое пороговое значение флуоресценции. Оно одинаково для всех совместно анализируемых проб, и осуществляется автоматически, не требуя дополнительных манипуляций по приготовлению фоновых образцов. При проведении же анализа методом FLASH существует необходимость введения отдельных фоновых пробирок.

Стандарты и калибраторы

Наиболее часто используются при осуществлении количественного анализа методом ПЦР. Введение этого типа контролей предполагает построение калибровочного графика в координатах с серией разведений ДНК-стандарта, из которого находят концентрацию субстрата в экспериментальных образцах.

Точность метода зависит от того, насколько условия ПЦР серии стандартов (прежде всего, эффективность амплификации) близки к условиям ПЦР экспериментальных образцов.

В тех случаях, когда требуется оценить «абсолютное» количество субстрата, выбор стандартов для градуировочного графика представляет собой сложную задачу.

Для определения количества матрицы в ПЦР-РВ существуют следующие варианты стандартов:

· Очищенный продукт ПЦР-РВ.

· Рекомбинантная РНК с последующей обратной транскрипцией.

Необходимо контролировать ход амплификации в каждой пробирке с реакционной смесью. Для этой цели используют дополнительный, так называемый "внутренний контроль". Он представляет собой любой препарат ДНК, несхожий с ДНК искомого микроорганизма. Если внутренний контроль внести в реакционную смесь, то он станет такой же мишенью для отжига праймеров, как и хромосомальная ДНК искомого возбудителя инфекции. Размер продукта амплификации внутреннего контроля подбирают таким образом, чтобы он был в 2 и более раз больше, чем ампликоны, образуемые от амплификации искомой ДНК микроорганизма. В результате, если внести ДНК внутреннего контроля в реакционную смесь вместе с испытуемым образцом, то независимо от наличия микроорганизма в биологическом образце, внутренний контроль станет причиной образования специфических ампликонов, но значительно более длинных (тяжелых), чем ампликон микроорганизма. Наличие тяжелых ампликонов в реакционной смеси будет свидетельством нормального прохождения реакции амплификации и отсутствия ингибиторов. Если ампликоны нужного размера не образовались, но не образовались также и ампликоны внутреннего контроля, можно сделать вывод о наличии в анализируемом образце нежелательных примесей, от которых следует избавиться, но не об отсутствии искомой ДНК.

К сожалению, несмотря на всю привлекательность такого подхода, у него есть существенный изъян. Если в реакционной смеси находится нужная ДНК, то эффективность ее амплификации резко снижается из-за конкуренции с внутренним контролем за праймеры. Это особенно принципиально важно при низких концентрациях ДНК в испытуемом образце, что может приводить к ложноотрицательным результатам.

Тем не менее, при условии решения проблемы конкуренции за праймеры, этот способ контроля эффективности амплификации безусловно будет весьма полезен.

Делись добром 😉

Похожие главы из других работ:

III. Внутренние половые органы

Влагалище представляет собой мышечно-фиброзную трубку длиной в среднем 8-10 см. Оно располагается в полости малого таза, примыкая спереди к мочеиспускательному каналу и мочевому пузырю, сзади — к прямой кишке. Стенки влагалища.

2. Внутренние факторы возникновения заболеваний. Роль наследственности в патологии

Этиология — это учение о причинах и условиях возникновения и развития болезней. Патогенез — учение о механизмах развития, течения и исхода болезней, патологических процессов и патологических состояний.

2.2 Патогенез сепсиса и его влияние на внутренние органы

Патогенез определяется возбудителем (вид, доза, вирулентность), особенностями первичного очага инфекции (локализация, состояние) и реактивностью организма больного.

3.4.1 Положительные контроли

В качестве "положительного контроля" используют препарат ДНК искомого микроорганизма. Неспецифические ампликоны отличаются по размеру от ампликонов, образуемых в результате амплификации с контрольным препаратом ДНК.

Раздел 1. Внутренние повреждения коленного сустава

Термином "внутренние" повреждения коленного сустава" чаще всего обозначают травму в остром периоде, когда из-за гемартроза.

2.1 Внутренние женские половые органы

Влагалище, матка, фаллопиевы трубы, яичники, маточные связки — внутренние женские половые органы, расположенные в полости малого таза. Брюшина отграничивает их от других органов малого таза и брюшной полости.

Интерпретация результатов ПЦР в реальном времени

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является мощнейшим инстументом современной молекулярной биологии. Так как в процессе реакции амплифицируется спецефический участок ДНК, ПЦР имеет огромный потенциал для использования в современной ветеринарной практике. Целевыми фрагментами для анализа могут быть, как и функциональные гены, так и отдельные консервативные или вариабельные локусы. Данные фрагменты называются молекулярно-генетическими маркерами. Благодаря молекулярным маркерам стало возможно проводить селекцию животных на совершенно новом уровне, значительно сокращая время выведения новых (или улучшения существующих) пород. Кроме того, молекулярно-генетические маркеры позволяют вести эффективный скрининг племенных животных по наследственным заболеваниям. Вторая особенность молекулярных маркеров – возможность определения видовой принадлежности любого организма – позволяет создавать очень точные и чувствительные тест-системы для детекции возбудителей различных заболеваний (в том числе бактериальных, грибковых, протозойных и вирусных – с точностью вплоть до отдельных штаммов, патотипов или изолятов) и определять состав кормов и сельскохозяйственной продукции (по наличию ДНК организмов, из которых они были изготовлены).

Более информативной и точной модификацией «классической» ПЦР является ПЦР в реальном времени. Этот метод является количественным (или полуколичественным) – в процессе ПЦР происходит постоянное наблюдение образца датчиком, регистрирующим флуоресцентные сигналы на каждом цикле реакции. Полученные в результате амплификационные кривые используются в дальнейшем анализе – по ним можно оценить, например, интенсивность экспрессии определенных генов (и, в следствии, проявление фенотипических признаков или наследственных заболеваний), вирусную нагрузку на организм больного животного (что позволяет выявить заболевание на ранних стадиях), оперативно (в отличие от бактериальных посевов) и точно (в отличие от ИФА) диагностировать бактериальные и протозойные заболевания.

Рассмотрим основные моменты, которые необходимо учитывать при интерпретации результатов ПЦР в реальном времени на примере исследования экспрессии генов.

Подготовка материала – выделение РНК.

Принцип выделения для всех нуклеиновых кислот один и тот же – лизис биоматериала, осаждение нуклеиновых кислот на субстрат, очистка от белков, жиров, углеводов, солей и клеточного дебриса, и элюция нуклеиновых кислот в раствор.
РНК является намного более лабильной молекулой, чем ДНК. Процесс деградации рибонуклеиновых кислот происходит на порядок быстрее. Этому способствует, во первых, их одноцепочечная структура, во вторых – большое количество РНКаз (ферментов, расщепляющих РНК), которые присутствуют как и в самих клетках, из которых производят выделение, так и на поверхности кожи оператора (и всех предметов и оборудования, с которыми он контактировал). Тем более, во многих протоколах выделения ДНК применяется дополнительная обработка образца РНКазами – появляется еще один источник контаминации рабочего места.
Рассмотрев эти особенности, можно выделить ряд обязательных для соблюдения правил подготовки образцов РНК:

  • Для уменьшения деградации от эндогенных РНКаз забор биоматериала должен быть проведен непосредственно перед выделением, биоматериал должен быть заморожен в жидком азоте. (Для
    разных наборов реактивов условия могут быть разными. Более подробные рекомендации описаны в протоколах выделения.)
  • Работать исключительно в перчатках и масках. Перчатки, посуду, оборудование и все рабочие поверхности следует обработать деактиватором РНКаз (чаще всего раствором ДЕПК).
  • Использовать воду, свободную от РНКаз (RNAse free).
  • Не допускать хранения образцов РНК и реактивов для их выделения рядом с растворами РНКаз.

Результаты ПЦР в реальном времени

Что можно измерить с помощью ПЦР в реальном времени?

Если вам необходимо проанализировать экспрессию генов, ПЦР в реальном времени может показать количество мРНК в образцах. В результате реакции амплифицируется небольшой регион мРНК, с помощью олигонуклеотидов и флуоресцентного зонда (как в методике TaqMan). Амплификатор (прибор, в котором происходит ПЦР) измеряет интенсивность флуоресценции зондов в образцах на протяжении каждого цикла. На первых циклах уровень флуоресценции недостаточен, чтобы его мог детектировать прибор, но при дальнейшем прохождении реакции он возрастает многократно. Кривая амплификации имеет так называемую экспоненциальную фазу, после которой следует фаза плато.

Ct (пороговый цикл) обозначает определенный цикл реакции и представляет собой одно из ключевых значений ПЦР в реальном времени. Пороговый цикл наступает, когда график кривой амплификации переходит в экспоненциальную фазу (на этой фазе отрезок кривой амплификации линейный). Порог (порог чувствительности, пороговое значение), который обозначен на рисунке красной прямой, пересекает кривую амплификации в точке наступления экспоненциальной фазы. Порог чуствительности может быть разным для разных видов анализа (если, например, используются разные методики анализа или исследуются разные гены), но всегда одинаковый для всех образцов в одной выборке (или в одном эксперименте).

Суть ПЦР в реальном времени заключается в том, что в каждом цикле реакции количество продукта удваиватся по сравнению с предыдущим. Если, например, значение Ct для двух реакций отличается на 2 цикла (см. рисунок), можно сделать вывод, что в образце А (обозначен фиолетовым графиком) в 4 раза больше копий мРНК, чем в образце Б (обозначен оранжевым графиком).

Чаще всего, данные, полученные в результате ПЦР в реальном времени, позволяют оценить так называемую «относительную экспрессию», то есть, насколько различается интенсивность экспрессии определенного гена у двух организмов. Однако, методика позволяет оценить и абсолютное значение экспрессии генов, но для этого необходимо создать стандарт, в роли которого обычно выступают клонированные целевые участки кДНК, интегрированные в вектор.

Словарь терминов:

Внутренний контроль (внутренний контрольный образец, ВКО). Контрольный ген, который присутствует во всех образцах в выборке.
Например, GAPDH, ACTB, TBP, HPRT, PPIA, YWHAZ.

Калибровочный образец. Калибровочным называют образец, по которому ведется сравнение полученных данных. Он представляет собой точку отсчета (time-zero). Значение RQ для контрольного образца равно 1, так как в таком случае он сравнивается с самим собой.

Ct = Пороговый цикл. Обычно ПЦР в реальном времени проходит в течение 40 циклов. Пороговый цикл наступает тогда, когда кривая амплификации пересекает линию порога чувствительности прибора (в месте, где график кривой амплификации становится линейным). Это значение необходимо для анализа. Чем выше значение порогового цикла (Ct=30-35), тем меньше мРНК находится в образце, так как нужно больше времени для амплификации необходимого для интенсивной флуоресценции количества копий мРНК. Если значение Ct невелико (10-15), это свидетельствует о том, что ген экспрессируется очень активно. Обычно внутренний контрольный образец имеет меньшее значение Ct, чем исследуемые гены.

Дельта Ct = Ct исследуемого гена – Ct внутреннего контрольного образца

Дельта Дельта Ct = ΔCt образца 1 – ΔCt калибровочного образца

Дельта Ct SD = Стандартное отклонение. Стандартное отклонение рассчитывается программным обеспечением по обработке данных анализа на основании значений Ct в трехкратном повторении. Данные достоверны, если Стд. откл. меньше 0,25. Если Стд. откл. Более 0,25, значению RQ доверять нельзя.

Реплики. Повторения (так называемые реплики) можно разделить на технические и биологические. Технической репликой является амплификация одного и того же материала, биологические реплики предполагают выделение мРНК и амплификацию из разного биологического материала.

RQ = Относительное количество = 2 – ΔΔCt. Значение RQ показывает количество продукта амплификации в технических репликах относительно калибровочного образца. Все образцы в рамках эксперимента будут сравниваться с калибровочным.

Например, если RQ=10, это значит, что в исследуемом образце экспрессия проходит в 10 раз более активно, чем в калибровочном. Значение RQ=0,1 говорит о том, что в исследуемом образце экспрессия проходит в 10 раз менее активно, чем в калибровочном.

Достоверными могут считаться данные, если RQ больше 2 или меньше 0,5. Это зависит от особенностей методики. Не исключено, что для одного и того же образца в один день можно получить значение RQ=0,8, а на следующий – 1,2. Если в ваших образцах предполагается малый разброс RQ (отличие в 1,5 раза от каибровочного образца), для анализа следует сделать биологические реплики образцов и они должны быть очень хорошо очищены. Кроме того, для каждого гена необходимо провести по 2 анализа и использовать ПКО с известным RQ.

RQmin и RQmax = диапазон возможных значений RQ с учетом стандартного отклонения ΔCt. Доверительный интервал должен быть 95%.
Если вам необходимо узнать действительную ошибку RQ, следует делать трехкратные биологические реплики. Это позволит выполнить тест Стьюдента для различных групп повторений.

Общее качество данных

При анализе полученных данных удостоверьтесь, что кривые амплификации не имеют резких пиков и параллельны друг другу. Технические реплики должны быть просканированы в пределах 0,5 цикла. Значения Ct должны быть

Оставьте первый комментарий

Оставить комментарий

Ваш электронный адрес не будет опубликован.